PRODUCTOS NATURALES OCULTOS EN LAS BACTERIAS ANTÁRTICAS

Kattia Núñez-Montero, Centro de Excelencia en Medicina Traslacional, Universidad de La Frontera. Instituto Tecnológico de Costa Rica. [email protected]

Leticia Barrientos Díaz, Centro de Excelencia en Medicina Traslacional, Universidad de La Frontera.

La Antártica se ha propuesto como una fuente promisoria de nuevos compuestos, principalmente derivados de bacterias, con aplicación en clínica y farmacia, ya que poseen vías metabólicas únicas y, por lo tanto, producen moléculas distintas debido a su proceso de adaptación a las múltiples condiciones extremas. En nuestro trabajo, realizado en la Universidad de La Frontera, caracterizamos la diversidad de los metabolitos secundarios que las bacterias antárticas son capaces de producir bajo distintas condiciones de cultivo y su relación con mecanismos bacterianos de supervivencia al ambiente extremo.

Los resultados mostraron condiciones que permiten la producción de una mayor diversidad de metabolitos secundarios en todas las bacterias evaluadas, por lo que este estudio destaca la importancia del uso de variaciones en los cultivos de bacterias para el descubrimiento de nuevas moléculas bioactivas en la exploración del continente antártico. Además, los estudios del genoma de estos microorganismos muestran que los genes que producen estas moléculas generalmente no siguen la misma tendencia de evolución que el resto del genoma. Estos pudieron ser adquiridos más recientemente como parte de una serie de mecanismos protectores ante las condiciones adversas a las que deben enfrentarse las bacterias antárticas.

El continente antártico alberga una gran diversidad de vida que no podemos observar. Se trata de los microorganismos, hongos y bacterias que solo pueden ser observados con microscopio, pero que están presentes en todos los ambientes explorados, incluyendo los menos pensados, como superficies de hielo, glaciares, dentro de rocas y en las profundidades marinas.

Estas formas de vida podrán parecer extrañas y extremas cuando las comparamos con las condiciones ambientales que conocemos como “favorables”. Sin embargo, los microorganismos antárticos han logrado sobrevivir en condiciones extremas, adaptando su biología y su comportamiento. Es decir, las condiciones ambientales de la Antártica han seleccionado los microorganismos ideales para habitar este lugar, mediante la evolución.

Por ello es de esperar que estos seres vivos produzcan moléculas distintas (y de gran interés para la ciencia) a las que encontramos usualmente en los ambientes más comunes. Una de las razones es porque nos ayudan a comprender los mecanismos involucrados en la adaptación a la Antártica, lo que podría permitir predecir efectos de futuros cambios ambientales y entender el origen de la vida en la Tierra. Además, estas moléculas tienen un gran potencial para el desarrollo de nuevos productos biotecnológicos o de interés en la clínica y la industria.

En la Antártica se ha encontrado una diversidad de compuestos principalmente relacionados con actividades antibiótica, antitumoral, enzimas de actividad en frío, entre otras.

Sin embargo, las búsquedas usualmente no consiguen acceder a la diversidad real de compuestos que un microorganismo es capaz de producir. Este problema se debe a un hecho biológico: las moléculas que buscamos están codificadas en el genoma de los microorganismos y tratamos de obtenerlas en laboratorio al hacerlos crecer. El problema es que no se producen todas las moléculas al momento de su crecimiento; esto sería energéticamente inviable para cualquier ser vivo. Al igual que en los humanos, nuestras células no activan todos sus más de 20.000 genes contenidos en el genoma.
Dependiendo de su tipo, cada célula produce y recicla las proteínas esencialmente necesarias para responder a la circunstancia en la que se encuentre. De la misma forma, cuando evaluamos los extractos de un microorganismo, estos solo van a contener una fracción de las moléculas que el microorganismo podría producir.

Las bacterias, en particular, son capaces de “sensar” las condiciones ambientales que las rodean, detectando compuestos químicos por medio de receptores en su superficie celular. Además, poseen un conjunto de compuestos que son especializados, conocidos como metabolitos secundarios, que se van a producir solamente cuando la situación así lo amerite.

Esto significa que la producción de estas moléculas depende de que la bacteria sea expuesta a una condición gatillante que permita la activación de una vía metabólica de respuesta. Nos referimos, por ejemplo, a respuestas de defensa por la presencia de un agente tóxico, de competencia por escasez de nutrientes o presencia de organismos antagónicos e incluso para la comunicación con otros microorganismos en el nicho ecológico.

Nuevas formas de explorar un universo desconocido

Conociendo esto, muchos autores han destacado la necesidad de aplicar nue- vas metodologías para lograr explorar la diversidad de compuestos “ocultos” en el genoma de las bacterias, en espe- cial en aquellas de ambientes extremos como la Antártica.

En el Laboratorio de Biología Molecular Aplicada de la Universidad de La Frontera, con el financiamiento del INACH, se ha realizado la biopros- pección en bacterias antárticas en el marco del proyecto de apoyo a tesis de posgrado titulado “Evolución de las actinobacterias al ambiente antártico y su potencial para el descubrimiento de moléculas antibióticas” (DG_01-19).

En este se caracterizó la capacidad de producción de metabolitos secundarios con actividad antibiótica de bacterias antárticas y su relación con los mecanismos bacterianos de supervivencia al ambiente extremo.

Para el estudio, en nuestro laboratorio se estableció el cultivo de bacterias antárticas en condiciones de elicitación o activación de metabolitos y, al menos, 12 medios de cultivo con composición nutricional distinta.

Los tratamientos de elicitación pre- tenden inducir la activación de metabolitos secundarios tras la exposición a agentes estresores en el medio. Uno de ellos fue el nitroprusiato de sodio (SNP), que es un reactivo químico que libera óxido nítrico al ser expuesto a la luz. El óxido nítrico es reconocido por múltiples organismos, incluidos las plantas y animales, como un señalizador celular, pero la respuesta bacteriana ante este químico no ha sido caracterizada.

Otro tratamiento fue el agregar lipopolisacáridos (LPS) bacterianos, compuesto que está presente en la superficie de las bacterias Gram negativas. Por lo tanto, el LPS sería interpretado como indicador de la presencia de posibles competidores en el medio.

Finalmente, se evaluó el cocultivo, inoculando dos cepas antárticas en el mismo cultivo para generar una competencia directa entre estas. De esta forma, se detectaron los metabolitos secundarios y su actividad antimicrobiana para cada una de las cepas evaluadas en, al menos, 48 condiciones de cultivo distintas, con el fin de acceder a la mayor cantidad de metabolitos posibles de cada cepa. Para ello, se evaluaron 34 cepas bacterianas, facilitándose el screening de los más de 1.600 cultivos mediante uso de microbiorreactores.
Se realizó la detección de la totalidad de los metabolitos producidos en cada condición, mediante una técnica de análisis llamada metabolómica basada en LC-MS/MS. Con esto se consiguió contabilizar entre 438 a 1.808 metabolitos en las cepas estudiadas. Esta técnica permite conocer el peso molecular, que podría entenderse como el tamaño de cada molécula producida, lo cual, a su vez, puede ser asociado con la diversidad metabólica de la bacteria. En este caso la diversidad de moléculas en las bacterias antárticas fue variable y en algunos casos se observaron compuestos de gran tamaño, que son poco frecuentes y de gran interés por su potencial rango de actividades biológicas.

Los resultados mostraron un aumento en la cantidad de compuestos producidos por las bacterias entre un 13 y 52 % cuando se aplicó algún tratamiento en cultivo. La respuesta a cada tratamiento fue variable según la cepa bacteriana y todos los tratamientos evaluados mostraron activación de compuestos en cantidades variables.

Debido a que las variaciones fueron dependientes del tipo de bacteria, no se puede generalizar un tratamiento o medio de cultivo que permita la obtención de mayor cantidad de moléculas. Sin embargo, estos resultados demuestran la utilidad y necesidad de aplicar múltiples tratamientos en el cultivo de la bacteria para la activación de vías metabólicas que se encuentran “apagadas” en condiciones normales de crecimiento, con el fin de estudiar sus propiedades benéficas.

Enfocándonos en la actividad biológica de los compuestos producidos, se evidenció que algunos de los tratamientos resultaron en el aumento de la actividad antimicrobiana, es decir, que fueron más eficientes en la eliminación de bacterias patógenas que son dañinas para el ser humano. Incluso, algunas cepas mostraron actividad inhibitoria contra bacterias Gram negativas que son resistentes a los tratamientos con antibióticos comunes. Este tipo de bacterias patógenas son causantes de la mayoría de las muertes por infecciones, por lo que los compuestos que se lograron activar en algunas de las condiciones evaluadas podrían ser de gran utilidad en el tratamiento de infecciones resistentes a antibióticos.

Dentro de las cepas con mayor po- tencial para el desarrollo de fármacos antibióticos se detectaron múltiples compuestos similares a la actinomicina, que es un antibiótico conocido. Estos fueron detectados en la bacteria Streptomyces fildesensis So13.3 y aumentaron su cantidad y bioactividad cuando se expuso a tratamientos de cocultivo. El resultado indica que esta especie podría contener variaciones estructurales del antibiótico actinomicina, que serían eficientes para la eliminación de patógenos. El estudio de esta especie bacteriana es interesante, porque ha sido únicamente descrita en el continente antártico y podría contener genes y moléculas naturales únicas como producto de la adaptación a este ambiente.

Por otra parte, con el objetivo de comprender el metabolismo en bacterias antárticas, se seleccionaron 11 cepas para secuenciar y estudiar de su genoma, el cual contiene toda información genética que permite la vida de un organismo. La secuencia completa de todos los genomas se obtuvo mediante tecnologías de secuenciación de última generación (Illumina y Oxford Nanopore Technologies). La combinación de estas tecnologías permitió obtener y reportar por primera vez los genomas completos de especies bacterianas adaptadas a las bajas temperaturas, los cuales no habían sido estudiados previamente.

Estos se encuentran depositados en la base de datos internacional GenBank de acceso público (bioproyectos: PRJNA605861 y PRJNA445286). En cada genoma se identificaron grupos de genes que participan en la síntesis de los metabolitos secundarios, mejor conocidos como BGC (por sus siglas del inglés Biosynthetic Gene Cluster). Estas fueron variables en cada genoma, desde 2 a 30 en los más prominentes y se destacó la gran cantidad de tipo de BGC relacionadas usualmente con la producción de compuestos naturales bioactivos y de aplicación clínica, entre ellos los tipos PKS (policéticos), NRPS (péptidos no ribosomales) y RiPP (péptidos ribosomales modificados postra- duccionalmente). Estos datos indican que las bacterias antárticas estudiadas son ricas en productos naturales de uso potencial en biotecnología, por ejemplo, para el desarrollo de nuevos fármacos.

Además, en términos del conocimiento científico, la alta diversidad y cantidad de BGC y compuestos especializados de las bacterias antárticas representan una oportunidad para la comprensión de su función en la adaptación de las bacterias a las condiciones complicadas del polo sur. Tras realizar análisis de comparación de genomas con otras especies bacterianas, se encontró que ninguno de los genes de producción de metabolitos secundarios está directamente relacionado con la adaptación a las condiciones del ecosistema antártico.

En otros trabajos se ha descrito que este tipo de material genético pudo haber sido adquirido de forma horizontal, mediante transferencia entre bacterias y no por herencia o evolución vertical. Esto quiere decir que su presencia en los genomas no está directamente ligada al proceso evolutivo que ha sufrido la bacteria, sino que en muchos casos ha dependido de la adquisición de estos genes desde otros microorganismos.

A pesar de esto, otros tipos de genes, relacionados con la resistencia al estrés oxidativo, resistencia a metales pesados y multirresistencia a antibióticos fueron encontrados con mayor frecuencia en las especies de bacterias antárticas. Es posible que la vida en un ambiente extremo induzca mecanis- mos, aún desconocidos, que aceleran una incorporación de material genético foráneo y mutaciones en regiones específicas que dan como resultado la resistencia a eventos o factores adversos generales.

Los avances en investigación de microorganismos antárticos nos han permitido reconocer este recurso como una fuente promisoria de nuevos productos naturales, que son necesarios para enfrentar los retos actuales que atentan contra la salud pública y la sociedad, como es el caso de la crisis de resistencia a antibióticos y las enfermedades emergentes. Sin duda, se requiere un mayor conocimiento y esfuerzos en ciencia para entender los procesos biológicos que dictan la disponibilidad y activación de los metabolitos bacterianos, pero este trabajo nos ayuda a evidenciar la utilidad de metodologías y tecnologías recientes para facilitar su exploración. También se espera que esta información pueda aumentar la compresión de los mecanismos que rigen el silenciamiento de genes y su rol ecológico en los ambientes extremos.